1. FUNDAMENTO
- INDOL: La triptofanasa es una enzima que degrada el triptófano: en ésta degradación se libera indol. Para detectar si una bacteria es capaz de degradar este aminoácido se usa un reactivo, denominado de Kovac, que reacciona con el indol formando un compuesto de color rosa intenso.
- ROJO DE METILO: Se realiza para determinar la capacidad de una bacteria de fermentar la glucosa por la vía ácido mixta, con producción de ácido. Para detectar si se han producido esos ácidos se utiliza un indicador de pH, el rojo de metilo, que actúa entre pH 4´2 (rojo) y 6´3 (amarillo).
- VOGES PROSKAUER: Para determinar la capacidad de una bacteria de fermentar la glucosa por vía butanodiólica. Para detectar este tipo de fermentación, se usa alfa-naftol, que es un compuesto que reacciona con un producto intermedio de la fermentación butanodiólica, la acetoína, para formar un compuesto de color rojizo.
- CITRATO: Esta prueba valora si una bacteria es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo. La prueba se realiza con agar Citrato de Simons, que contiene citrato de sodio y azul de bromotimol como indicador de pH.
2. OBJETIVO
Identificación
de enterobacterias.
3. MATERIAL Y REACTIVOS
Gradilla,
pipetas pasteur, 2 tubos con agua de peptona, 4 tubos con MRVP y 2 tubos con
agar citrato.
Bacterias
3 y 7.
Reactivo
de kovac, alfa-naftol al 5 %, KOH al 40 %, rojo de metilo.
4. PROTOCOLO
- INDOL
1. Inocular una o dos colonias en caldo de
peptona e incubar 24 h a 37ºC.
2. Añadir 5 gotas de reactivo de Kovac al
caldo de cultivo.
 |
| Reactivo de Kovac |
3. Efectuar la lectura: banda de color rosa
intenso es indol- positiva por lo tanto, positividad para degradar triptófano.
Banda de color amarillo es indol negativo por lo que no tiene capacidad de
degradar el triptófano.
- ROJO DE METILO
1. Suspender un inóculo en el medio de cultivo
MRVP y mezclar por rotación.
2. Incubar durante 24h a 37ºC.
3. Añadir 5 gotas de solución indicadora de
rojo de metilo.
4. Efectuar la lectura: color rojizo es
positiva a la fermentación de glucosa por la vía ácido mixta, si el color es
amarillo es negativa a la fermentación de la glucosa por la vía ácido mixta.
- VOGES PROSKAUER
1. Suspender el inóculo en el medio de
cultivo MRVP, que es un medio líquido que contiene glucosa, y mezclar por
rotación.
2. Incubar durante 24 h a 37ºC.
3. Añadirle 12 gotas de alfa-naftol al 5% en
etanol y 4 gotas de KOH al 40%.
 |
| Alfa-naftol |
 |
| KOH |
4. Agitamos por rotación y dejamos abierto e
inclinado.
5. Esperar 5-10 min y efectuar la lectura:
medio de color rosado es positiva a acetoína por lo que fermenta glucosa por la
vía butanodiólica. Medio de color amarillo es negativa a acetoína por lo que no
fermenta glucosa por la vía butanodiólica.
- CITRATO
1. Realizar una siembra por agotamiento en
la superficie del agar inclinado.
2. Incubar durante 24 h a 37ºC y efectuar la
lectura: azul intenso es citrato positiva y si el medio no cambia de color es
citrato negativa.
5. MEDIDAS DE SEGURIDAD
1.
Es imprescindible uso de bata de laboratorio y guantes desechables.
2.
Lavarse las manos con agua y jabón cada vez que iniciemos y finalicemos las
prácticas.
3.
La zona de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Desinfectar la
superficie de trabajo antes y después de realizar el trabajo con lejía o
alcohol (etanol 96°).
3.
No es necesario el encendido del mechero bunsen ya que no hay que realizar las
practicas en condiciones de esterilidad, sólo es necesario para la preparación
de medios de cultivo..
4.
Cuando se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la
boca, nariz, ojos, etc. por nuestra propio seguridad.
6. RESULTADO
INDOL: Banda
amarilla en las dos bacterias son indol negativo por lo que no tienen
capacidad de degradar el triptófano.
ROJO DE METILO: medio amarillo en las dos bacterias por lo que son negativas a la fermentación de la glucosa por la vía ácido mixta.
VOGES PROSKAUER: Medio de color amarillo en las dos bacterias por lo
que son negativas a acetoína y no fermentan glucosa por la vía butanodiólica.
CITRATO: el medio de ambas bacterias no cambia de color por
lo que son citrato negativa.
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