PRÁCTICA 1: PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

1. FUNDAMENTO

El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos. La composición precisa dependerá de la especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varían considerablemente.  Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normales  y microorganismos muy exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer.

2. OBJETIVO

Preparar medios de cultivo como soporte y fuente de nutrientes para el desarrollo de los microorganismos in vitro, hacer un primer acercamiento a la manipulación de microorganismos y adquirir la idea de la importancia del trabajo en condiciones de esterilidad y las técnicas más comunes para realizarlo.

3. MATERIAL Y REACTIVOS

Probeta, frasco de 500ml, vidrio de reloj, piseta, embudo, placas de Petri, Agar nutritivo, balanza, microondas, tubos, gradilla, pipeta y pim-pum.

4. PROTOCOLO    

Agar nutritivo en placa de petri

1. Preparamos el material.

2. Llenamos la probeta con 300ml de H₂O destilada y rotulamos el material (fecha, grupo y AN).

3. Pesamos el AN en la balanza.

4. Mezclamos en el frasco el agua y AN y a continuación, lo calentamos en el microondas y lo sacamos antes de que comience a hervir.

5. Metemos la disolución en el autoclave para esterilizarla, el tapón del frasco no tiene que estar del todo enroscado y debemos enganchar un papel rotulado al tapón con lo que contiene el frasco.

6. Una vez finalizado, la sacamos y ponemos 25ml de AN en cada placa de petri. 

7. Esperamos a que el AN solidifique y metemos las placas de petri cubiertas en papel albal en el frigorífico debidamente rotulado. 

 Agar nutritivo en tubo indicado

1. Preparamos el material y lo rotulamos.

2. Pesamos el AN en la balanza.

3. Llenamos con  250ml de agua destilada en la probeta.

4. Mezclamos en el frasco el agua y AN y a continuación, lo calentamos en el microondas y lo sacamos antes de que comience a hervir.

5. Vertemos 10ml con la pipeta en cada tubo.

6. Metemos la gradilla con los tubos en el autoclave cubiertos con papel albal.

7. Una vez finalizado, sacamos los tubos y los ponemos en posición semi- horizontal apoyados en la base de la gradilla y esperamos a que el AN solidifique y metemos los tubos cubiertos de papel albal en el frigorífico debidamente rotulado.

Caldo nutritivo

Este procedimiento es igual que el procedimiento que se realiza en AN en tubo indicado pero no hay que colocarlos en posición semi-horizontal para que solidifiquen por lo que una vez que salgan del autoclave los metemos los tubos (que pueden ser más pequeños que los que utilizamos en el otro procedimiento) en el frigorífico.

• USO DE AUTOCLAVE  

1. Sacamos el cestillo y llenamos el autoclave con agua destilada hasta cubrir la resistencia y volvemos a meter el cestillo con los materiales que queremos esterilizar. 

2. Cerramos el autoclave y lo enchufamos. 

3. Cerramos la válvula de drenaje y dejamos abierta la válvula de vapor. 

4. Programamos el autoclave a 121ºC durante 20min. 

5. Cuando el autoclave alcance los 100ºC cerramos la válvula de vapor. 

6. Una vez que el autoclave termine, cuando la temperatura se sitúe debajo de los 100ºC y a una atmósfera de presión comenzamos a abrir la válvula de vapor poco a poco, y una vez que esté a 0 atmósferas ya podemos abrir la válvula de vapor y el autoclave. 

• OPERACIONES  

X = 300ml × 23gr de AN ÷ 1000ml = 6´9gr de AN 
 

5. MEDIDAS DE SEGURIDAD 

 - Mantener la esterilidad mientras estamos echando el AN a las placas de Petri, para ello debemos pasar la boca del frasco por el mechero para esterilizarla y no hablar durante el proceso.

- Utilizar la cabina de seguridad, debemos encenderla 10min antes de utilizarla con la luz ultravioleta y cuando la vayamos a utilizar ponemos la luz blanca y quitamos la ultravioleta porque puede dañarnos los ojos. Debemos desinfectar el interior de la cabina con un algodón y alcohol.